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菌種為什么會衰退?常見菌種衰退原因及預防措施

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微生物長期受到外界的影響,遺傳性狀必然發生某些變異。正是由于變異的存在才使得生物向前進化。然而由于突變的存在,菌種在培養或保藏過程中,可能會出現某些優良生產性狀的劣化、遺傳標記丟失、典型特征改變等現象,稱為菌種衰退。比如蘇云金芽孢桿菌由于菌種衰退,導致其新生的菌體芽孢和伴孢晶體都比較??;保藏的沙門氏菌鞭毛抗原丟失,導致H多價血清不凝固等。

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菌種衰退原因

菌種衰退的根本原因是有關基因的負突變。如果控制產量的基因發生負突變,則表現為產量下降;如果控制孢子生成的基因發生負突變,則產生孢子的能力下降。菌種在移種傳代過程中會發生自發突變。雖然自發突變的幾率很低(一般為10-6~10-9),尤其是對于某一特定基因來說,突變頻率更低。但是由于微生物具有極高的代謝繁殖能力,隨著傳代次數增加,衰退細胞的數目就會不斷增加,在數量上逐漸占優勢,最終成為一株衰退了的菌株。此外,菌種衰退還有以下幾種原因:

 

1、表型延遲造成菌種衰退

表型延遲現象也會造成菌種衰退。如,在誘變育種過程中,經常會發現某菌株初篩時產量較高,進行復篩時產量卻下降了。

 

2、質粒脫落導致菌種衰退

質粒脫落導致菌種衰退的情況在抗生素生產中較多,不少抗生素的合成是受質??刂频?。當菌株細胞由于自發突變或外界條件影響(如高溫),致使控制產量的質粒脫落或者核內DNA和質粒復制不一致,即DNA復制速度超過質粒,經多次傳代后,某些細胞中就不具有對產量起決定作用的質粒,這類細胞數量不斷提高達到優勢,則菌種表現為衰退。

 

3、連續傳代

連續傳代是加速菌種衰退的一個重要原因。一方面,傳代次數越多,發生自發突變(尤其是負突變)的幾率越高;另一方面,傳代次數越多,群體中個別的衰退型細胞數量增加并占據優勢越快,致使群體表型出現衰退。

 

4、不適宜的培養和保藏條件

不適宜的培養和保藏條件是加速菌種衰退的另一個重要原因。不良的培養條件如營養成分、溫度、濕度、pH值、通氣量等和保藏條件如營養、含水量、溫度、氧氣等,不僅會誘發衰退型細胞的出現,還會促進衰退細胞迅速繁殖,在數量上大大超過正常細胞,造成菌種衰退。

 

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防止菌種衰退措施

采用已衰退菌種進行生產會影響生產效率,而把已衰退菌種作為陽性菌株進行檢驗,則會影響檢驗正確率。既然變異是不可避免的,那么我們應該如果避免菌種衰退呢?

 

1、控制傳代次數

盡量避免不必要的移種和傳代,把必要的傳代減少到最低的水平以減少突變幾率。傳代次數越多,產生突變的幾率就越大,菌種發生衰退的機會就越高。在實驗室檢驗或者是生產實際中,應嚴格控制傳代次數。中國藥典當中規定,培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5代,以防止菌株因傳代次數過多引起衰退影響檢驗。

 

2、利用不同類型細胞進行接種傳代

放線菌,霉菌用菌絲進行移種比分生孢子容易衰退,因菌絲是對核且有異核存在,所以移種霉菌適宜采用孢子。

 

3、良好的培養條件

不良的培養條件會衰退細胞的出現,因此采用適宜的培養基進行菌種培養,以減少衰退幾率

 

4、采用有效的菌種保藏方法

根據保存時間的長短,選擇適宜的保存方法。

 

·傳代培養法:復蘇后的第一代放于4℃冰箱或室溫保存,定期傳代培養。保藏時間依微生物種類而定。如,芽孢、霉菌、酵母菌保存6個月轉一次,普通細菌1個月轉一次,假單胞菌2周轉一次

 

·甘油凍存法:將復活后經過性能確認的菌株新鮮培養物(一般是第二代菌株),用0.85%的滅菌生理鹽水(約1-2ml)洗斜面菌苔成菌懸液;將上述菌懸液吸取適量于滅菌管(凍存管)中(如,滅菌管容量為5ml,則取1.5ml菌液),加入等體積的40%滅菌甘油,混勻,密封。保藏溫度為—20℃,一般可保存1-2年。

 

·瓷珠保存管保存:菌株保藏管內含特制的小珠(20-25顆)和特殊溶液,只需將培養好的菌株接入溶液中,搖勻成菌懸液,細胞即吸附于小珠上,然后吸出溶液,將保藏管置-70℃可保存5年,置-20℃可保存2-3年。

 

 

小貼士







瓷珠保存管保存具體操作:

第一步:對需要保存的菌株進行必要的純化,挑取生長旺盛時期的菌落,接入菌株

保藏管中,通常需要接入4-7環,對于苛養菌應多接一些;

第二步:擰上蓋子,充分劇烈震蕩;

第三步:用無菌吸管將溶液吸走,盡可能吸干;

第四步:馬上放入冰箱中,溫度越低越有利于保存(推薦使用-70℃超低溫冰箱);

第五步:復蘇時,只需將小珠在平板上滾動或置肉湯中培養。

 

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